Development of antibacterials directed against the thymidylate synthase ThyX in Mycobacterium tuberculosis : mechanism kinetic and in silico inhibitor optimisation
Développement d’antibactériens dirigés contre la thymidylate synthase ThyX de Mycobacterium tuberculosis : cinétique du mécanisme et optimisation in silico d’inhibiteurs
Résumé
Tuberculosis is a global health issue as the recent data from World Health Organization indicates that one third of the human population is infected with a dormant form of tuberculosis. Consequently, 9 million new cases and 1.5 million deaths caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the etiological agent of tuberculosis, were reported in 2014. The treatment for tuberculosis lasts at least 6 months and excessive or misuse of currently available anti-tuberculosis agents has led to the rise of multi and extensively resistant forms of this important human pathogen. The dissemination of Mtb resistant strains is alarming and the need for new therapeutic agents and targets to fight these Mtb strains is urgent.
During my thesis, I have investigated reaction and inhibition mechanism of Mtb ThyX. ThyX catalyses the synthesis of deoxythymidine monophosphate (dTMP) by the methylation of carbone 5 of deoxyuridine monophosphate (dUMP), using N5,N10-methylenetetrahydrofolate and NADPH as carbon and hydride donors respectively. As ThyX is absent in humans and they are structurally and mechanistically distinct from analogous human enzyme, these proteins are a promising therapeutic target in Mtb and many other pathogenic bacteria. Moreover, recent genome wide studies of clinical isolates have revealed overexpression of Mtb thyX in some multi-resistant isolates of Mtb suggesting an involvement in a compensatory pathway in the mechanism of acquisition of drug resistance.
I have studied the kinetics of Mtb ThyX mechanism under steady-state conditions and by using time resolved spectroscopy. I showed the selectivity of the enzyme for NADPH, and studied the dynamics of dUMP and NADPH binding in the Mtb ThyX active site as well as the reactivity of the flavin cofactor with molecular oxygen. These studies have explained how Mtb, a strict aerobe, can synthetize thymidylate even in the presence of molecular oxygen, despite the reduced flavin-factor (obligatory intermediate of the reaction) is highly oxygen reactive.
A second part of my work focused on identifying Mtb ThyX inhibitors with antimycobacterial activity. Two approaches were used: i) selecting naphthoquinone derivatives, by similarity searching, or by picking previously reported compounds with anti-Mtb activity but of unknown target(s), and testing them for Mtb ThyX inhibition ; ii) Developing a pharmacophore model that can be used for screening chemical libraries in silico and/or prioritizing further compounds for additional experimental testing.
These approaches have led to the identification of several new Mtb ThyX inhibitors with low micromolar inhibition constants while no significant inhibition was observed on human thymidylate synthase. The inhibition modes of this new set of compounds suggest a novel binding site on Mtb ThyX than previously observed on other ThyX proteins. The most potent compounds like idebenone or 2-[(4-methoxyphenyl)methyl]-1,4-dihydronaphthalene-1,4-dione also exhibit moderate activity against clinical strains of Mtb.
The precise binding site of these compounds remains unknown and will require further investigation to guide SAR studies to optimize these inhibitors. Updating the pharmacophore model will allow to select new compounds to be tested in vitro. Idebenone has already passed phase 1 and 2 clinical trials for duchenne muscle dystrophy, exhibiting good ADME-tox properties. Repurposing idebenone derivatives to target ThyX in Mtb will be the focus of future work.
La tuberculose est un problème de santé mondial. D'après l'OMS, un tiers de la population mondiale est infectée par une forme dormante et on recense chaque année 9 millions de nouveaux cas et 1,5 million de morts. Le traitement de la tuberculose est d'au moins 6 mois et un usage excessif d'antibiotiques a induit l'apparition de formes résistantes de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent étiologique de la tuberculose. La dissémination de ces souches, résistantes aux traitements de première et seconde ligne, suscite aujourd'hui beaucoup d'inquiétudes et le besoin en nouvelles molécules ou cibles thérapeutiques est urgent.
Durant ma thèse, j'ai étudié la réaction et l'inhibition de la tymidylate synthase flavine-dépendante essentielle ThyX de Mtb. ThyX catalyse la synthèse de déoxythymidine monophosphate (dTMP) en méthylant la position 5 de la deoxyuridine monophosphate (dUMP) et elle utilise le N5,N10-méthylènetetrahydrofolate et le NADPH comme donneurs de méthylène et d'hydrure respectivement. ThyX est surexprimée dans les souches cliniques résistantes aux antituberculeux, et a également été identifiée comme voie de sauvetage dans les mécanismes de développement de résistances. Absente chez l'Humain, elle représente une cible thérapeutique prometteuse.
J'ai étudié la cinétique du mécanisme de ThyX Mtb à l'équilibre et par spectroscopie résolue en temps. J'ai mis en évidence la sélectivité de substrat de l'enzyme pour le NADPH et étudié la dynamique de l'accessibilité du dUMP et du NADPH au site actif de ThyX Mtb pendant la réaction, ainsi que la réactivité du cofacteur flavine réduit avec le dioxygène, un point de mécanisme important pour un organisme aérobe tel que Mycobacterium tuberculosis. Ces études ont permis de comprendre comment Mtb peut synthétiser de dTMP malgré la haute réactivité de la flavine réduite (intermédiaire de la réaction) avec le dioxygène.
Une seconde partie de mon travail a eu pour objectif l'identification d'inhibiteurs de ThyX Mtb avec un pouvoir antimycobactérien. Deux approches ont été utilisées : i) établissement d'une liste de dérivés naphthoquinones incluant, des molécules sélectionnées par similarités de structure ainsi que des composés déjà décrits comme inhibiteurs de Mtb mais de cible inconnue, que j'ai testé contre ThyX Mtb in vitro ; ii) le développement d'un modèle pharmacophore qui permet le crible in silico de molécules.
Ces deux approches ont permis l'identification de plusieurs nouveaux inhibiteurs de ThyX avec des constantes d'inhibition de quelques micro molaires tandis qu'aucune inhibition significative de la thymidylate synthase humaine n'a été observé. Les modes d'inhibition de ces molécules suggèrent un site de fixation différent des naphthoquinones sur ThyX Mtb. De plus, les molécules les plus prometteuses telle que l'idebenone ou 2-[(4-methoxyphenyl)methyl]-1,4-dihydronaphthalene-1,4-dione présentent un pouvoir antibactérien modéré contre des souches cliniques de Mycobacterium tuberculosis.
Le site de fixation de ces nouvelles molécules devra être identifié par des travaux à venir. Cela permettra de guider les études de relation structure activité afin d'optimiser ces composés. La mise à jour du modèle pharmaocphore permettra également de sélectionner de nouvelles molécules à tester in vitro. L'idebenone a déjà passé les phases 1 et 2 d'essais cliniques pour la myopathie de Duchenne, ce qui suggère que ses propriété pharmacocinétiques sont acceptable. La réorientation des dérivés d'idebenone pour cibler ThyX dans Mtb en conservant ses propriétés et sa faible toxicité sera au centre de futurs projets.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
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