Dynamique interne des flavoprotéines étudiée par spectroscopie femtoseconde
Internal dynamics of flavoproteins studied by femtosecond spectroscopy
Résumé
Nature employs charge transfer reactions in many biological functions. Redox-active cofactors like flavins (FAD and FMN) are often implicated in such reactions. Charge transfer in proteins often proceeds via formation of radical intermediates. The amino acid radicals of tyrosine (TyrOH) and tryptophan are thought to play important roles as intermediates in intra- and interprotein charge transfer reactions. Tryptophanyl radicals (both protonated cation and deprotonated neutral forms), had been characterized before. However, tyrosyl radicals had only been characterized in the neutral form, and were thought to be formed by concerted electron extraction and deprotonation of tyrosine. Short-lived intermediates are often difficult to observe in biochemical reactions, but may be populated when they can be photochemically formed using short light pulses.In this work, we have characterized intermediates in non-functional charge transfer reactions in flavoproteins using femtosecond time-resolved fluorescence and absorption spectroscopy. Excited states and product states formed in the wild type and mutant forms of the methyltransferase flavoenzyme TrmFO from Thermus thermophilus were investigated. In the TrmFO active site, a tyrosine (Tyr343), is closely stacked on the FAD isoalloxazine ring and a cysteine (Cys51) can form a highly fluorescent adduct with the FAD. In the mutant C51A, FADox fluorescence is strongly quenched by electron transfer from the Tyr343 in ~1ps. The resulting product state displayed a distinct spectral feature- a strong absorption band at ~490 nm unlike any previously characterized radical species. It was assigned to the radical cation of tyrosine (TyrOH•+) which had never been observed before. The FAD•-TyrOH•+ intermediate, is very short-lived as it decays in ~3ps, through charge recombination. As a general conclusion, despite the very low pKa of TyrOH•+, electron transfer from tyrosine can occur without concomitant proton transfer.Using polarization photoselection experiments, we estimated the dipole moment direction for this new transition. The resultant angle between the excited FADox transition and the probed TyrOH•+ transition in C51A TrmFO was 31º±5º. This result sets the orientation of the dipole moment of the transition in the molecular frame of the phenol ring. The finding of distinct directions for the excited FAD transition band and the 490 nm transition confirms their origin in different molecular entities.Following the results from TrmFO, we reinvestigated the photochemistry in the model flavoprotein glucose oxidase (GOX). Here, both tryptophan and tyrosine residues are located in the vicinity of FAD and the photoproduct evolution on the picosecond timescale is more complex. Distinct phases of excited state decay with time constants of 1ps and ~4ps were observed, as well as phases of ~4ps, ~37 ps and a longer-lives phase for product state evolution. Consequently, a comprehensive model for the involvement of radicals of tyrosine and tryptophan and, the different FAD redox states, in the light-induced charge separation and recombination in GOX was made. Partial involvement of the TyrOH•+ radical cation, spectrally similar to C51A TrmFO, was required for the 4 ps and 37 ps phases to account for the ensemble of data. This result explains previous enigmatic features and indicates the involvement of TyrOH•+ in a variety of protein systems.So far, only the deprotonated tyrosyl radical TyrO• had been observed as a functional intermediate in several systems. The visualization of protonated TyrOH•+ radical in TrmFO C51A and GOX suggests the possibility of its intermediate formation as a precursor of TyrO• in functional biochemical reactions.Finally, in TrmFO the construction of specific variants with site-directed mutagenesis was initiated to study active-site flexibility using electron transfer rates as conformational markers. Further experimental and modeling work is required to pursue this goal.
La nature utilise des réactions de transfert de charge (TdC) dans de nombreuses fonctions biologiquesfaisant intervenir des cofacteurs à activité redox, comme les flavines (FAD et FMN). Le TdC dans les protéines s’effectue souvent par la formation d'intermédiaires radicalaires. Les acides aminés tyrosine(TyrOH) et tryptophane sont impliqués comme intermédiaires majeurs. Les radicaux tryptophanyle ont été caractérisés auparavant dans leurs formes protoné et déprotoné. Cependant, les radicaux tyrosyles n'ont été caractérisés que dans la forme neutre et on pensait qu'ils étaient formés par extraction électronique et déprotonation. Les intermédiaires à courte durée de vie sont souvent difficiles à observer dans les réactions biochimiques, mais peuvent être peuplés s'ils sont formés photochimiquement par de courtes impulsions.Nous avons caractérisé des intermédiaires dans des réactions non-fonctionnelles de TdC dans des flavoprotéines en utilisant la spectroscopie femtoseconde de fluorescence et d'absorption. Des états excités et produits formés dans le type sauvage et des formes mutantes de la flavo-enzyme méthyltransférase TrmFO de Thermus thermophilus ont été étudiés. Dans le site actif de cette enzyme, une tyrosine (Tyr343) est empilée sur le cycle isoalloxazine de la FAD, et une cystéine (Cys51) peut former un adduit avec la FAD très fluorescente. Dans le mutant C51A, la fluorescence du FADox est fortement quenchée par transfert d'électrons de la Tyr343 dans ~1 ps. L'état produit résultant présente une caractéristique spectrale distincte avec une forte bande d'absorption à ~490 nm, encore jamais associée à aucune espèce radicalaire, qui a été attribuée pour la première fois au cation radical de la Tyr343 (TyrOH•+). L’état FAD•-TyrOH•+, est de très courte durée car il retombe par recombinaison de charge en ~3 ps.. Cette étude démontre que- malgré le très bas pKa de TyrOH•+ -le transfert d’électrons à partir de la tyrosine peut avoir lieu sans transfert concomitant de proton.De plus, des expériences de photosélection par polarisation ont permi d’estimer, l’orientation du moment dipolaire de la nouvelle transition entre FADox et TyrOH•+ dans le TrmFO C51A à 31°±5°. Ce résultat évalue l'orientation du moment dipolaire au sein du cycle phénolique. La découverte de directions distinctes pour la bande de transition de la flavine excitée et la transition à 490 nm confirme leur origine dans différentes entités moléculaires.Sur la base des résultats de TrmFO, nous avons réexaminé la photochimie de la flavoprotéine modèle glucose oxydase (GOX). Ddes résidus de tryptophane et de tyrosine sont situés proche du FAD et l'évolution du photoproduit à l'échelle picosecondes est plus complexe. Des phases de déclin de l'état excité avec des constantes de temps de 1 et ~4 ps ont été observées, ainsi que des phases pour l'évolution de l'état produit de ~4 ps, ~37 ps et une phase plus longue. Un modèle complet de la séparation et de recombinaison des charges dans GOX impliquant, des radicaux de tyrosine et de tryptophane, ainsi que des différents états redox du FAD a été décrit. Les résultats pour les phases de 4 ps et de 37 ps mettent en évidence l’implication du radical TyrOH•+, avec des caractéristiques semblables au C51A TrmFO. Ce résultat explique des caractéristiques énigmatiques connues et indique l'implication de TyrOH•+ dans divers systèmes protéiques.A ce jour, seul le radical tyrosyle déprotoné TyrO• a été identifié comme intermédiaire fonctionnel dans plusieurs systèmes. La visualisation d'un radical TyrOH•+ dans TrmFO C51A et GOX suggère sa formation intermédiaire en tant que précurseur de TyrO• dans des réactions biochimiques fonctionnelles.Enfin, dans TrmFO, la construction de variantes spécifiques par mutagénèse dirigée a été initiée pour étudier la flexibilité du site actif en utilisant la vitesse de TdC comme marqueur conformationnel. D'autres travaux sont nécessaires pour poursuivre cette voie.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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